酶切出現(xiàn)問(wèn)題，先看內(nèi)切酶說(shuō)明書，相應(yīng)試劑公司目錄。不同公司出產(chǎn)的內(nèi)切酶，菌株來(lái)源、制備工藝、純度活力、酶切活性優(yōu)化可能不同，酶切效果也有差別?？稍谏厦嬲业矫竼挝欢x、保存條件、酶切體系[buffer及與其它酶雙切的buffer等]、酶切反應(yīng)溫度[有些酶是在50、55或30等溫度下反應(yīng)的]、酶是否受甲基化影響、是否有星號(hào)活性及出現(xiàn)星號(hào)活性可能因素、保護(hù)性堿基，同尾酶、同裂酶等等。
1. 酶切不開或不*
1.1 質(zhì)粒問(wèn)題：純度差或殘留酶切抑制物zui為常見。雜蛋白存在會(huì)影響酶切，表現(xiàn)為A260/A280低于1.8；抑制物常見酚、鹽、乙醇等。[重新提DNA，使用可靠試劑盒或可靠手工提取試劑]
1.2 酶的問(wèn)題：確認(rèn)內(nèi)切酶有效 [很多內(nèi)切酶雖然有過(guò)期時(shí)間，但過(guò)期后只要能夠有效酶切，可用。確認(rèn)酶切效果不好，做標(biāo)記，更換] 。
【題外話：用內(nèi)切酶注意】
a. 內(nèi)切酶如無(wú)特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油緩沖液中，溫度過(guò)低時(shí)，酶會(huì)發(fā)生凍結(jié)（運(yùn)輸過(guò)程例外，由于酶需要低溫運(yùn)輸，所以方便的情況下是使用干冰，酶會(huì)凍結(jié)，但凍結(jié)次數(shù)有限，相對(duì)是一種比較好的選擇），如果是經(jīng)常使用的話，酶會(huì)被反復(fù)凍融，從而降低了活性。當(dāng)然如果溫度過(guò)高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用時(shí)應(yīng)置于冰盒中取酶。這點(diǎn)大家都清楚，不過(guò)多強(qiáng)調(diào)也沒壞處。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室有些同學(xué)，酶取出后是放在冰盒上的，但有兩點(diǎn)忽略了：拿酶的時(shí)候，手不是抓著管子上端，而握在管子的底部，相當(dāng)于用手在給酶進(jìn)行加熱；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的時(shí)候，還是將酶拿出來(lái)。偶爾一次沒有大礙，反復(fù)如此，可能會(huì)影響酶活。
c. 酶使用完后應(yīng)盡快旋緊蓋子。有時(shí)我們可以發(fā)現(xiàn)，即使是-20~-30度放置，酶仍然會(huì)凍結(jié)。個(gè)人認(rèn)為的可能原因是由于在配置酶切反應(yīng)時(shí)，酶管的蓋子在較長(zhǎng)時(shí)間的開著，甘油會(huì)吸取空氣中的水分，對(duì)于常用的大包裝的酶有時(shí)就會(huì)出現(xiàn)凍結(jié)現(xiàn)象。此外，有時(shí)由于操作不小心，冰盒上凝結(jié)的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出現(xiàn)過(guò)兩次，汗....）
d. 吸取酶時(shí)的tips。我們常用來(lái)取酶的tips都是zui小的那種，適合2ul和10ul的槍，但tips通常有兩種，一種是zui常用的短的tips，用它取酶時(shí)，tips挨著酶液后，槍幾乎是要插入管子，有時(shí)會(huì)在槍身上沾上酶液。因此，可能會(huì)產(chǎn)生污染。那么我們必要非常注意動(dòng)作，要么就換用另一種長(zhǎng)的 tips，專門取酶液用。
1.3 buffer問(wèn)題。有些酶切的buffer中，添加了一些較為容易析出或溶解的成分[連接酶的buffer更是這樣]，有時(shí)酶切的buffer沒有*融化時(shí)，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時(shí)間后，融化部分的離子濃度會(huì)變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對(duì)離子濃度敏感的內(nèi)切酶時(shí)就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。
1.4 雙酶切的buffer選擇：確認(rèn)使用的是正確的buffer和反應(yīng)溫度[具體可以參考各廠家提供的酶切buffer以及雙酶切buffer的資料，其中，NEB的可以參見
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm
1.5 酶切位點(diǎn)的甲基化影響：有時(shí)甲基化會(huì)影響酶切，常見的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的質(zhì)粒，質(zhì)粒就會(huì)因大腸桿菌的Dam、Dcm被甲基化；如果是直接從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的DNA，則部分DNA就會(huì)因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點(diǎn)被甲基化后，酶切會(huì)受影響。因此，出現(xiàn)酶切不開或不全時(shí)需要考慮甲基化的問(wèn)題。甲基化通常出現(xiàn)在特定序列，以Xba I為例，僅當(dāng)序列位5'-【TCTAGA】TC-3'時(shí)，Xba I的位點(diǎn)才會(huì)被甲基化，并非所有的Xba I位點(diǎn)都會(huì)出現(xiàn)甲基化。
具體的列表可以參考
http://www.biocolors.com.cn/en/gsxw_p.asp?N_id=12
http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/alteration.htm
其中，克隆常用的酶切位點(diǎn)見下表：
Restriction Enzyme Methylation
Sequence &Site Methylation Type Enzyme Activity Blocked?
AarI 5'...CACCTG cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCC cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCCc WGG...3' D partially
BclI 5-TGaTCA...3' A Compley
BglI 5'...GCC（N）5GG cG...3' C partially
BglI 5'...GCc WGGNNGGC...3' D Compley
Esp3I 5'...CGTCTC...3' E Compley
HincII 5'...GTYRA cG...3' C partially
HinfI 5'...GANT cG...3' C partially
HpaII 5'...CCGG...3' E Compley
HphI 5'...GGTGa TC...3' B Compley
MboI 5'...GaTC...3' A Compley
NheI 5'...GCTAG cG...3' C partially
NmuCI 5'...GTCA cG...3' C partially
NotI 5'...GCGGCCGC...3' E Compley
PvuI 5'...CGATCG...3' E Compley
RsaI 5'...GTA cG...3' C partially
SalI 5'...GTCGAC...3' E Compley
SatI 5'...G cG GC...3' C Compley
SmaI 5'...CCCGGG...3' E Compley
XbaI 5'...TCTAGa TC...3' B Compley
XhoI 5'...CTCGAG...3' E partially
Type A: a - N6-methyladenine （m6A）
Type B: a - N6-methyladenine （m6A）, Partially Overlap Dam Methylase Site GATC
Type C: c - 5-methylcytosine （m5C），Overlap CG
Type D: c - 5-methylcytosine （m5C） ，Partially Overlap Dcm Methylase Site CCWGG
Type E: m5CG or m5CNG（這種修飾主要發(fā)生在植物和動(dòng)物來(lái)源的DNA）
1.6 酶切體系問(wèn)題：通常較大的反應(yīng)體系（>=50ul），較少量的質(zhì)粒（<=1ug,或更少），酶切的會(huì)更加*一些。
1.7 酶切或雙酶切時(shí)，保護(hù)性堿基及近末端位點(diǎn)堿基個(gè)數(shù)的問(wèn)題。在酶切PCR產(chǎn)物時(shí)，酶切位點(diǎn)旁的堿基個(gè)數(shù)可能會(huì)影響酶切效率。同樣，在雙酶切載體時(shí)，如果兩個(gè)載體相鄰過(guò)近，也有可能會(huì)影響酶切效果。這個(gè)問(wèn)題以前也曾有討論，具體可以參考
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8577107&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#8577107
關(guān)于相關(guān)的資料可以參見：
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm [針對(duì)PCR產(chǎn)物酶切位點(diǎn)保護(hù)性堿基的資料]
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_vector.htm [針對(duì)載體酶切位點(diǎn)近末端位點(diǎn)堿基個(gè)數(shù)對(duì)酶切影響的資料]
2. 質(zhì)粒酶切時(shí)出現(xiàn)smear。
2.1 體系中的內(nèi)切酶含量過(guò)高：通常酶切體系中的內(nèi)切酶含量不宜超過(guò)酶切體系的10％，不管是單一酶切還是雙酶切，酶的含量在5％以下是比較合適的。由于酶是保存在50％甘油緩沖液中，過(guò)高的酶用量會(huì)導(dǎo)致甘油含量提高，而從引起酶的星活性；
2.2 酶切反應(yīng)過(guò)程中有導(dǎo)致星活性的因素：有些內(nèi)切酶除了對(duì)甘油濃度外，對(duì)離子濃度、反應(yīng)溫度、酶含量、反應(yīng)時(shí)間等都可能產(chǎn)生星活性。所以在使用內(nèi)切酶時(shí)，一定要留意說(shuō)明書中的描述，避免可能出現(xiàn)星活性情況的發(fā)生。減少酶用量、合適的反應(yīng)溫度、不進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的酶切反應(yīng)，可減少星活性的出現(xiàn)。
2.3 酶切體系可能污染了其它物質(zhì)：如其它的DNA、其它的內(nèi)切酶或DNA酶等。
參考貼：
限制性內(nèi)切酶的熱失活：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893410&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893410
內(nèi)切酶星號(hào)活性：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893487&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893487
限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893511&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893511
進(jìn)37度之前，用vortex或移液槍混一下更好，能把壁上的液體旋掉!
但注意槍頭不要盡量沾帶上溶液，減少體系損失！
限制性內(nèi)切酶的熱失活
熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡(jiǎn)便易行的方法。大多數(shù)zui適反應(yīng)溫度是37℃的酶在65℃下溫育20分鐘即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃，溫育20分鐘也可失活。下表注明了每種酶的失活條件。
在50μl的反應(yīng)體系中，37℃條件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作為底物，加入5-10μl內(nèi)切酶及相應(yīng)緩沖液，反應(yīng)60分鐘，然后升溫至65℃或 80℃溫育20分鐘進(jìn)行熱失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常為λDNA），調(diào)節(jié)溫度至zui適反應(yīng)溫度，溫育60分鐘。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或*被消化，則表明該酶沒有*被熱失活。
內(nèi)切酶星號(hào)活性
在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不*相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號(hào)活性。有人提出，這種"星號(hào)"活性可能是內(nèi)切酶的一種普遍特性（1），如果提供給相應(yīng)反應(yīng)條件，所有內(nèi)切酶都會(huì)出現(xiàn)非特異性切割。NEB已證實(shí)下列酶存在星號(hào)活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。
酶識(shí)別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號(hào)活性的反應(yīng)條件影響。常見的引起酶識(shí)別改變的條件有：?jiǎn)螇A基替換、識(shí)別序列外側(cè)堿基縮短以及單鏈切刻（10）。Polisky等（4）對(duì)EcoR I的早期研究表明，在低鹽濃度、高pH值條件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；zui近，Gardner等（11）的研究表明，只要識(shí)別中心的四堿基序列（AATT）不出現(xiàn)A/T替換，EcoR I可以切割其它任何單堿基替代序列。
大多數(shù)星號(hào)活性是可以控制的，做酶切反應(yīng)時(shí)一般不考慮這方面的因素。只要在正常條件下，使用隨酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性。下面列出了導(dǎo)致或抑制星號(hào)活性的因素。
導(dǎo)致星號(hào)活性的因素：
1. 較高的甘油濃度（>5% v/v）；
2. 酶與底物DNA比例過(guò)高（不同的酶情況不同，通常為>100 U/µg）；
3. 低鹽濃度（<25 mM）
4. 高pH值（>pH 8.0）
5. 存在有機(jī)溶劑（如DMSO、乙醇（9）、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane（12）等）
6. 用其他二價(jià)離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）
以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I對(duì)甘油濃度更敏感，而后者則對(duì)高pH值更敏感一些（2）。
抑制星號(hào)活性的方法：
1. 盡量用較少的酶進(jìn)行*消化反應(yīng)。這樣可以避免過(guò)度消化以及過(guò)高的甘油濃度。
2. 盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時(shí)引入的乙醇）的污染。
3. 將離子濃度提高到100-150 mM（若酶活性不受離子強(qiáng)度影響）。
限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基（不太懂）:
限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基，這些堿基對(duì)內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。保護(hù)堿基常見于PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，為保護(hù)5` 端外加的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使酶切*而添加。其次，在分子克隆時(shí)，選擇載體的酶切位點(diǎn)也會(huì)碰到，相臨的2個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過(guò)少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。
保護(hù)堿基的具體設(shè)計(jì)可以可以看圖:
我有點(diǎn)不明白，上圖是檢測(cè)內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù)，怎么能作為保護(hù)堿基的設(shè)計(jì)用呢？我設(shè)計(jì)引物是隨機(jī)設(shè)計(jì)保護(hù)堿基也切得很好呀？望樓主及戰(zhàn)友們賜教
的確，上圖是檢測(cè)內(nèi)切酶在切割不同寡核苷酸時(shí)的效率數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)不僅考慮到末端堿基數(shù)量的影響，同時(shí)還考慮到了末端堿基組成對(duì)酶切效率的影響，*存在推敲的是，這些數(shù)據(jù)是使用“寡核苷酸”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
也就是說(shuō)，保護(hù)性堿基的設(shè)計(jì)，除了要考慮“堿基個(gè)數(shù)”外，“堿基組成”也是要考慮的。當(dāng)然，我們大多數(shù)戰(zhàn)友，包括我自己，考慮zui多的是“堿基個(gè)數(shù)”，對(duì)“堿基組成”的考慮通常是采用隨機(jī)，或兼顧引物Tm及GC％上。
因此，只考慮“堿基個(gè)數(shù)”是比較省事的選擇，且似乎還沒有出現(xiàn)問(wèn)題，至少我的實(shí)驗(yàn)還沒有出現(xiàn)因?yàn)?/span>“堿基組成”不當(dāng)而影響酶切的事情。
下表是引自TAKARA的，我個(gè)人覺得應(yīng)該適合NEB、MBI、PROMEGA等其它的酶，它給出的結(jié)果僅考慮了“堿基個(gè)數(shù)”，對(duì)我們可能有幫助。
我做了一次酶切,雖然有目的條帶（載體和目的基因,目的基因不是很明顯,相反在其下方的條帶更明顯）,也就是說(shuō)有雜帶,請(qǐng)問(wèn)這結(jié)果的肯能原因.
我的菌株是從其他老師那里得來(lái)的,提取出來(lái)的質(zhì)粒好象比理想的要大（理想4000左右,跑出來(lái)的比5000大）.雙酶切質(zhì)粒載體很明顯（pUC2700左右）,就是目的基因1400位置比較模糊（還是有）,900左右位置卻更明顯,而且下方還有雜帶. 按道理不應(yīng)該酶把目的基因切斷. 請(qǐng)問(wèn)可能的原因有哪些啊,怎么改進(jìn)啊.謝謝了.
1. “理想4000左右,跑出來(lái)的比5000大” —— 質(zhì)粒是否經(jīng)過(guò)單酶切處理？如果只是簡(jiǎn)單的將質(zhì)粒進(jìn)行電泳，數(shù)據(jù)是不具有參考意義的。
2. “目的基因1400位置比較模糊（還是有）,900左右位置卻更明顯,而且下方還有雜帶. 按道理不應(yīng)該酶把目的基因切斷.” —— 仔細(xì)分析一下酶切位點(diǎn)，確認(rèn)除了外源片斷兩端外沒有其它的內(nèi)部切點(diǎn)。
附圖，這樣可以更好的討論問(wèn)題。
需要去掉質(zhì)粒上eGFP后的中止子,用于融合表達(dá),方法是:在eGFP片斷的上下游分別設(shè)計(jì)引物做pcr后連接,上游加BamH1的酶切位點(diǎn),下游加Bgl2的酶切位點(diǎn)（同質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn),不能改）.
pcr沒有問(wèn)題,連接也有菌落長(zhǎng)的很好,但是挑了40多個(gè)克隆,都是自連的,（我沒有用堿性磷酸酶磷酸化質(zhì)粒）.BamH1和Bgl2的粘性末端是一樣的,但是pcr都沒有,所以考慮是自連.
其他因素排除后,我覺得可能是引物合成出錯(cuò)導(dǎo)致pcr產(chǎn)物不能酶切,就又在另一個(gè)公司合成了引物,但是重新做的連接,挑了10個(gè)菌做pcr還是陰性.
我現(xiàn)在懷疑是不是引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題了,我在酶切位點(diǎn)前面加的保護(hù)性堿基會(huì)不會(huì)影響酶切的效率.請(qǐng)高手幫忙看一下我的引物,謝謝
上游: ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC
下游: ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC（由于融合表達(dá),加了幾個(gè)弱性aa）
限制性內(nèi)切酶酶切注意事項(xiàng)
在進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)過(guò)程中，影響限制性酶切反應(yīng)效果的因素較多，要設(shè)計(jì)酶切反應(yīng)，一般均應(yīng)考慮諸如酶切系統(tǒng)、溫度條件、反應(yīng)體積、底物性質(zhì)及星型反應(yīng)等因素。根據(jù)各種不同的
條件，酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)一般應(yīng)注意以下問(wèn)題：
1. 大多數(shù)限制酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)zui終反應(yīng)液中甘油濃度大于12％時(shí)，某些限制酶的識(shí)別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會(huì)抑制酶活
性。因此加入反應(yīng)的酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。
2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長(zhǎng)期保存。
3. 反應(yīng)體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當(dāng)用其它二價(jià)陽(yáng)離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時(shí)，酶活性會(huì)被抑制，或改變酶的特異性，導(dǎo)致星型反應(yīng)。
4. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非zui適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機(jī)溶劑的存在。
5. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過(guò)高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。
6. 酶切反應(yīng)所加入的酶量應(yīng)適中，根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對(duì)不同的限制酶，各廠家均有一zui大的消化量指標(biāo)可參考。
7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時(shí)切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：
①先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應(yīng)；
②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。
8. 用同一種酶切割不同的DNA時(shí)，所需酶量不同，可根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與λDNA存在位點(diǎn)的數(shù)目比較后，決定用酶量。對(duì)于超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。
9. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。
10.酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、 yi mi，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過(guò)量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。
11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個(gè)重要因素，所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。
12.要保證酶作用時(shí)的*反應(yīng)條件（ph, 溫度）和底物用量，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。
13.反應(yīng)取酶時(shí)應(yīng)使用無(wú)菌吸頭，以免污染酶液，同時(shí)應(yīng)盡量縮短酶在溫室的放置時(shí)間。
14.高于37℃或需長(zhǎng)時(shí)間保溫時(shí)，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。
15.反應(yīng)混合物混勻時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。
16.反應(yīng)前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已硅化的離心管進(jìn)行酶切反應(yīng)，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。
18.終止酶反應(yīng)可根據(jù)需要采用不同的方法：①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng)（如連接，切割等），可將反應(yīng)管置65℃保溫20-30分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作。
19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時(shí)請(qǐng)查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。
二、限制性酶解中常見的問(wèn)題及解決措施：
限制性酶切割DNA底物的操作過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，產(chǎn)生的原因主要為酶解體系中各要素處于非*狀態(tài)，包括DNA的純度和特性，反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)體積、反應(yīng)時(shí)間及溫度等。
問(wèn)題
原因
解決辦法
DNA*沒有被內(nèi)切酶切割
1） 內(nèi)切酶失活。用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性
2） DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子。將DNA過(guò)柱純化，乙醇沉淀DNA
3） 條件不適（試劑、溫度）。檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否*？
4） DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化。換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株
5） DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）。換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I），重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增
6） DNA位點(diǎn)上存在其它修飾。將DNA底物與λDNA混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證
7） DNA不存在該酶識(shí)別順序。換用其它的酶切割DNA或過(guò)量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證
DNA切割不*
1） 內(nèi)切酶活性下降。用5-10倍量過(guò)量消化
2） 內(nèi)切酶稀釋不正確。用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶
3） DNA不純，反應(yīng)條件不佳。同上
4） 內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾。同上
5） 部分DNA溶液粘在管壁上。反應(yīng)前離心數(shù)秒
6） 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)。將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積
7） 酶切后DNA粘末端退火。電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷
8） 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性。使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩
9） 過(guò)度稀釋使酶活性降低。適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏
10）反應(yīng)條件不適。使用*反應(yīng)體系
11）識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序。加大酶量5-10倍
DNA PIAN段數(shù)目多于理倫值
1） 內(nèi)切酶星狀活性
檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過(guò)低，Mn2+的存在及酶：DNA值過(guò)大均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量
2） 其它內(nèi)切酶污染
用λDNA作底物檢查酶切結(jié)果
3） 底物中含其它DNA雜質(zhì)
電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA pian段
酶切后沒有觀察到DNA pian段的存在
1） DNA定量錯(cuò)誤（如RNA含量較高）
用RNA酶A（無(wú)DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量
2） 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀
在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次
內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活
1） 保存溫度不合適
內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在-20℃低溫保存
2） 以稀釋形式保存
稀釋酶液不宜長(zhǎng)期存放，應(yīng)一次使用
3） 貯藏緩沖液不適當(dāng)
使用廠家推薦的貯藏緩沖液
4） 低蛋白濃度
內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存
電泳后DNA PIAN段的帶型彌散，不均一
1） DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)
電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的SDS，酚/lv fang抽提純化
2） 內(nèi)切酶中含有DNA外切酶
減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶
酶切后的DNA pian段連接效率低
1） 含磷酸鹽的濃度高
透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽
2） 內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶
延長(zhǎng)滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3） 平末端連接
加大T4 DNA Ligase用量
4） 外切酶污染
減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收DNA
5） 連接緩沖液不合適
重新配制
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